Пейеровы бляшки тонкая кишка

Биология и медицина

Пейеровы бляшки

Лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми покровами и представленая в виде узелковых скоплений, лишенных замкнутого соединительнотканного футляра, в тонком кишечнике получила название пейеровых бляшек . Групповые (обобщенные) лимфоидные узелки, или пейеровы бляшки, располагаются главным образом в стенке подвздошной кишки , имеют вид плоских образований преимущественно овальной или круглой формы, чуть- чуть выступающих в просвет кишки- это одиночные лимфоидные узелки диаметром 0,5 — 3 мм, а также скопления лимфоидных узелков, называемые Пейеррвыми бляшками. Количество их в детском возрасте достигает 50, в 16 — 17 лет составляет 33- 37. После 40 лет оно не превышает 20, а после 60 лет — 16. Групповые лимфоидные узелки построены из одиночных узелков, между которыми располагаются тонкие пучки соединительнотканных волокон. Лимфоидная ткань, расположенная в стенке кишки, выполняет защитную и кроветворную функции.

Попадая в кишечник, антигены проникают в пейеровы бляшки через специализированные эпителиальные клетки и стимулируют антигенреактивные лимфоциты.

Лимфоциты этих образований представлены как B-клетками , так и Т-клетками . Среди В-клеток более 50% имеют поверхностный IgA . Оставшаяся часть представлена клетками с поверхностными IgM и IgG . Продуцирующие антитела плазмоциты и Т-клетки способны проникать в слизистую оболочку кишки, находящуюся в прямом контакте с бляшками ( рис. 6.11 ). Кроме того, в слизистой находятся фагоцитирующие клетки, которые поглощают патогены, оказавшиеся на эпителиальной слизистой поверхности кишечного просвета. После активации они с лимфой проходят через мезентериальные лимфатические узлы , попадают в грудной проток, затем в кровь и в lamina propria, где превращаются в клетки, продуцирующие IgA, и в результате такой широкой распространенности защищают обширный участок кишечника, синтезируя протективные антитела.

Таким образом, пейеровы бляшки являются эффективным инструментом защиты от проникновения патогена через желудочно-кишечный тракт.

Морфологические особенности пейеровых бляшек тонкой кишки интактных крыс Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Морозова Е. Н.

Дослідження було проведено на 24 білих безпородних інтактних щурах-самцях різних вікових груп. Метою роботи було вивчити морфологічні особливості пейерових бляшок тонкої кишки інтактних щурів. Результати дослідження показали зміни кожного кількісного параметра в період росту тварин (з 5-6 по 10-11 місяць), що дозволяє припустити наявність вікових змін у пейєрових бляшках тонкої кишки інтактних щурів. В подальших дослідженнях планується вивчити морфологічні особливості пейерових бляшок при імуности-муляції та імуносупресії в експерименті.Целью работы явилось изучить морфологические особенности пейеровых бляшек тонкой кишки интактных крыс . Результаты исследования показали изменения каждого количественного параметра в период роста животных (с 5-6 по 10-11 месяц), что позволяет предположить о наличии возрастных изменениях в пейеровых бляшках тонкой кишки интактных крыс . В дальнейших исследованиях планируется изучить морфологические особенности пейеровых бляшек при иммуностимуляции и иммуносупрессии в эксперименте.

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Морозова Е. Н.,

Текст научной работы на тему «Морфологические особенности пейеровых бляшек тонкой кишки интактных крыс»

удк 612. 017. 1:616-092. 9

морфологические особенности пейеровых бляшек тонкой

кишки интактных крыс

Государственное заведение «луганский государственный медицинский университет»

Работа является частью научно-исследовательской темы кафедры гистологии, цитологии, и эмбриологии ГЗ «Луганский государственный медицинский университет» «Особливост будови деяких оргашв iмунноí, ендокринноТ та нервовоТ систем пщ впливом екзогенних чинниюв», (государственный регистрационный номер 010би006009), «Особливостi будови оргашв iмунноТ та ендокринноТ систем при iмуностимуляцiТ та iмуносупресiТ» (государственный регистрационный номер 0112и000096).

вступление. Морфологические исследования органов иммунной системы животных, которая является основной защитной системой организма, показало, что линейные параметры тимуса, селезенки, лимфатических узлов зависят от возраста и обладают высокой реактивностью на экзогенные и эндогенные воздействия [2, 3, 4, 5, 6]. Основываясь на данных современной литературы, пейеровы бляшки (ПБ) тонкой кишки являются вторичными органами иммунной системы [1, 7], которые представляют одну из первых линий защиты от проникновения патогенов, поэтому их нормальное морфо-функциональное состояние — это одно из условий, от которых зависит постоянство внутренней среды, как тонкой кишки, так и всего организма в целом.

Исходя из этого, целью работы явилось изучить морфологические особенности пейеровых бляшек тонкой кишки интактных крыс.

Объект и методы исследования. Исследование было проведено на 24 белых беспородных ин-тактных крысах-самцах разных возрастных групп, которые были разделены на 4 группы (3-4, 5-6, 7-9 и

10-11 месяцев постэмбрионального раз- _

вития) по шесть животных в каждой.

Содержание и манипуляции над лабораторными крысами проводились в соответствии с правилами, установленными «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

После выведения животных из эксперимента в соответствии со сроками наблюдения выделяли тонкую кишку, при помощи рулетки измеряли ее длину, подсчитывали количество ПБ. Штангенциркулем определяли линейные параметры

ПБ (длину, толщину и ширину, расстояние между бляшками, а тагже от илеоцекального угла до первой из них). Затем тонкую кишку фиксировали в 10 % растворе формалина. Гистологические препараты органа изготавливали по стандартной методике, окрашивали их гематоксилин-эозином, а затем изучали при помощи аппаратно-программного комплекса. Морфометрические измерения (высота и ширина лимфатических узелков, межузелковых зон и герминативных центров ПБ) проводили при помощи лицензионной программы «МогрИо!од». Полученные данные обрабатывали при помощи

Свидетельство о регистрации СМИ Эл № ФС77-52970

Изучение барьерных свойств фолликул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек тонкой кишки крысы Фальчук Евгений Леонидович

Диссертация — 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат — бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Фальчук Евгений Леонидович. Изучение барьерных свойств фолликул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек тонкой кишки крысы: диссертация . кандидата Биологических наук: 03.03.01 / Фальчук Евгений Леонидович;[Место защиты: Институт физиологии им.И.П.Павлова Российской академии наук], 2016.- 135 с.

Содержание к диссертации

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1 Тканевые барьеры 12

1.2 Молекулярная структура и функционирование комплекса плотных контактов 22

1.3 Роль семейства клаудина в формировании барьерных свойств и регуляция барьерных свойств плотных контактов компонентами среды 27

1.4 Лимфоидная система, ассоциированная со слизистой кишки 42

1.5 Структурно-функциональная организация Пейеровых бляшек 45

1.6 Транспорт антигенных структур через фолликул-ассоциированный эпителий 48

1.7 Барьерные свойства фолликул-ассоциированного эпителия 51

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 55

2.1 Подготовка препаратов ткани 55

2.2 Регистрация электрофизиологических характеристик в камере Уссинга 56

2.3 Изучение эпителиального сопротивления методом одноканальной импедансной спектроскопии 59

2.4 Изучение проницаемости эпителия с помощью флуоресцентно-меченного декстрана различной молекулярной массы 61

2.5 Изучение комплекса белков плотных контактов методом Вестерн-блот анализа 62

2.6 Изучение гистологической структуры препаратов с помощью световой микроскопии 65

2.7 Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов для изучения локализации белков плотных контактов з

2.8 Расчет корректирующего коэффициента на основе морфометрического анализа гистологического строения ткани Пейеровых бляшек и ворсинчатого эпителия 68

2.9 Статистическая обработка полученных данных 72

ГЛАВА 3. Изучение электрофизиологических характеристик фолликул-ассоциирвоанного эпителия пейеровых бляшек тощей кишки крысы 74

3.1 Электрофизиологические характеристики Пейеровых бляшек разных сегментов тонкой кишки 74

3.2 Сравнительный анализ электрофизиологических характеристик Пейеровых бляшек и ворсинчатого эпителия тощей кишки крысы 78

3.3 Изучение вклада эпителиального и субэпителиального сопротивления в общее сопротивление Пейеровых бляшек и ворсинчатого эпителия тощей

ГЛАВА 4. Изучение проницаемости фолликул ассоциированного эпителия пейеровых бляшек тощей кишки для молекул декстрана 85

ГЛАВА 5. Изучение белков плотных контактов в фолликул ассоциированном эпителии пейеровых бляшек тощей кишки крысы 89

5.1 Определение уровня белков плотных контактов в эпителии Пейеровых бляшек и ворсинчатом эпителии тощей кишки 89

5.2 Изучение локализации белков плотных контактов в эпителии Пейеровых бляшек и ворсинчатом эпителии тощей кишки 92

Список литературы 108

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Изучение механизмов функционирования тканевых барьеров и их роли в регуляции постоянства внутренней среды представляет собой актуальную проблему современной физиологии висцеральных систем. Основной структурой тканевых барьеров является слой эпителиальных клеток, объединенных в единый функциональный пласт с помощью межклеточных соединений, среди которых именно плотные контакты определяют проницаемость межклеточного пути (Gnzel and Fromm, 2012). Тканевые барьеры регулируют транспорт ионов, воды и молекул между внешней и внутренней средой и предотвращают транслокацию патогенных структур в организм. Показано, что нарушение проницаемости эпителиального слоя в результате дисфункции комплекса плотных контактов может приводить к развитию воспалительных процессов и аллергий (Barmeyer et al., 2015).

Тканевой барьер, сформированный эпителиальным слоем слизистой оболочки
кишечного тракта, подвергается постоянной антигенной нагрузке. Расположенная в
стенке кишки лимфоидная система, ассоциированная со слизистой, обеспечивает развитие
иммунной реакции в ответ на проникновение патогенных вирусов и бактерий и
одновременно поддерживает иммунологическую толерантность по отношению к
компонентам пищи и комменсальным бактериям (Mowat, 2003). Основным элементом
иммунной системы кишечника являются Пейеровы бляшки – сгруппированные
лимфоидные фолликулы, покрытые со стороны полости кишки фолликул-

ассоциированным эпителием (Jung et al., 2010).

В составе фолликул-ассоциированного эпителия наряду с энтероцитами имеются специализированные М-клетки, главной функцией которых является перенос антигенных структур по трансцеллюлярному пути из просвета кишки к расположенным ниже иммунным клеткам (Owen and Jones, 1974; Sakhon et al., 2015). В литературе также имеются данные о роли субэпителиальных дендритных клеток, отростки которых проникают по парацеллюлярному пути между энтероцитами, таким образом, представляя альтернативный способ захвата и переноса бактерий через эпителиальный барьер (Rescigno et al., 2001).

Нельзя исключать проникновение антигенов пищи или патогенов микробиоты кишки по межклеточному пути. Некоторые авторы предполагают, что апоптоз эпителиоцитов фолликул-ассоциированного эпителия и исчезновение барьерных свойств этой структуры способствует проникновению микроорганизмов по парацеллюлярному пути (Tamagawa et al., 2003). Однако данному предположению противоречат сведения о

том, что в тонкой кишке кролика Пейеровы бляшки характеризуются большим
трансэпителиальным сопротивлением, по сравнению с расположенным рядом участком
кишки, покрытым ворсинками (Brayden and Baird, 1994). До настоящего времени остается
неясным, является ли данная особенность барьерных свойств фолликул-ассоциированного
эпителия Пейеровых бляшек характерной только для кролика или существует и у других
видов животных. Кроме этого, известно, что Пейеровы бляшки отличаются по структуре и
клеточному составу от участков стенки кишки с ворсинками (Neutra et al., 2001).
Возможно, что увеличение трансэпителиального сопротивления Пейеровых бляшек
связано не с уменьшением проницаемости фолликул-ассоциированного эпителия, а с
особенностями субэпителиального клеточного состава. Таким образом,

электрофизиологические параметры, отражающие барьерные свойства фолликул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек кишки, остаются до настоящего времени не исследованными.

Молекулярными компонентами плотных контактов, которые определяют парацеллюлярную проницаемость эпителиального пласта, являются белки семейства клаудина (Gnzel and Fromm, 2012). Установлено, что распределение представителей данного семейства в эпителии различных сегментов кишки совпадает с их барьерными свойствами (Markov et al., 2010). Данные о наличии и распределении клаудинов в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек немногочисленны. С помощью иммуногистохимии в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек кишки мыши показана локализация клаудина-2, -3 и -4 (Tamagawa et al., 2003), однако информация об уровне данных белков и наличии остальных представителей семейства клаудина в этом эпителии отсутствует.

Известно, что отдельные представители белков плотных контактов, например, клаудин-2 (Liu et al., 2013), а также клаудин-3 и клаудин-4 (Katahira et al., 1997; Sonoda, 1999), обеспечивают трансэпителиальный перенос антигенных структур, выступая в качестве их рецепторов. Изменение количества и локализации других белков семейства, клаудина-5 и клаудина-8, приводит к развитию воспалительных заболеваний кишечника (Zeissig et al., 2007). Таким образом, проведение комплексного анализа барьерных свойств фолликул-ассоциированного эпителия и плотных контактов, в частности, на основе различных методов является необходимым для определения его роли в обеспечении антигенного гомеостаза в кишечнике.

Таким образом, целью данной работы является изучение барьерных характеристик фолликул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек и проведение сравнительного анализа с барьерными характеристиками эпителия ворсинок тощей кишки.

Задачи исследования:

Изучение электрофизиологических характеристик фолликул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек тонкой кишки и сравнение их с электрофизиологическими характеристиками эпителия ворсинок тощей кишки.

Исследование проницаемости фолликул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек для макромолекул различной молекулярной массы в сравнении с проницаемостью эпителия ворсинок, расположенного рядом.

Определение уровня белков плотных контактов в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек тощей кишки и сравнение с уровнем в эпителии ворсинок, расположенным рядом.

Анализ локализации белков плотных контактов в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек тощей кишки и в эпителии ворсинок, расположенным рядом.

Научная новизна. Впервые для исследования барьерных свойств эпителия
Пейеровых бляшек тощей кишки крысы был применен комплексный подход, сочетающий
в себе электрофизиологические, молекулярно-биологические и иммунохимические
методы. В результате проведенного исследования получены новые данные о том, что для
ткани Пейеровых бляшек тощей кишки крысы характерно большее по сравнению с
эпителием ворсинок тощей кишки трансэпителиальное, субэпителиальное и

эпителиальное сопротивление. Впервые показано, что в основе различных барьерных свойств исследуемых тканей лежит сниженная проницаемость парацеллюлярного пути фолликул-ассоциированного эпителия для макромолекул. Получены принципиально новые данные о белковом составе плотных контактов эпителия Пейеровых бляшек. Новыми и оригинальными являются данные о том, что уровень отдельных представителей семейства белка клаудина в эпителии Пейеровых бляшек отличается по сравнению с расположенным рядом эпителием ворсинок. Впервые определена локализация белков клаудинов в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек тощей кишки крысы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Исследование направлено на изучение фундаментальной проблемы физиологии висцеральных систем – роли тканевых барьеров в формировании и сохранении постоянства внутренней среды организма, в частности, сохранении антигенного гомеостаза в организме. Полученные в ходе работы данные расширяют представление о механизмах функционирования Пейеровых бляшек, основного элемента лимфоидной системы слизистой оболочки кишки, и позволяют сделать предположение о том, что сниженная проницаемость межклеточного

пути является предпосылкой для транспорта антигенных структур через М-клетки. Практический интерес представляют собой данные об уровне отдельных представителей семейства белка клаудина в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек, так как в настоящее время барьер, формируемый плотными контактами, рассматривается в качестве пути для доставки лекарств и вакцин в организм. Результаты диссертации используются в курсах лекции по физиологии, читаемых на биологическом факультете Санкт-Петербургского государственного университета.

Методология и методы исследования. Для выполнения поставленных задач применяли электрофизиологические и молекулярно-биологические методы, позволяющие провести комплексную оценку барьерных свойств различных участков тощей кишки крысы. Данные о сопротивлении и проницаемости ткани получены с помощью камеры Уссинга, метода одноканальной импедансной спектроскопии, исследовании диффузии FITC-декстрана. Изучение комплекса плотных контактов осуществлялось методом Вестерн-блот с последующей денситометрией и методом иммуногистохимии с оценкой иммунофлуоресценции на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фолликул-ассоциированный эпителий Пейеровых бляшек кишки крысы
обладает выраженными барьерными свойствами, что свидетельствует об ограничении
парацеллюлярного транспорта в этой структуре.

2. В пределах одного сегмента тощей кишки характер распределения
клаудинов в рядом расположенных клеточных популяциях эпителия соответствует
изменению их барьерных свойств.

Личный вклад автора. Автор внес значительный вклад в разработку научной гипотезы, планирование научного исследования, стандартизацию методов выполнения исследования и обсуждение и анализ полученных результатов. Данные, представленные в работе, получены лично автором или при его непосредственном участии в проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация результатов исследования. Результаты исследования были

представлены для обсуждения на XIV Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье» (2011 год, Санкт-Петербург, Россия); VIII Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 220-летию со дня рождения академика К.М. Бэра «Механизмы функционирования висцеральных систем» (2012 год, Санкт-Петербург, Россия); 94-ой Ежегодной Конференции Немецкого Физиологического Сообщества (2015 год, Магдебург, Германия); 24-ой, 25-ой и 26-ой Европейской конференции по изучению

транспорта в эпителии кишки (2011 года, Оксфорд, Англия; 2013 год, Бад-Херренальб, Германия; 2014 год, Марстранд, Швеция).

По теме диссертации опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК, и 6 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 269 источников. Диссертация иллюстрирована 1-ой таблицей и 21-им рисунком.

Роль семейства клаудина в формировании барьерных свойств и регуляция барьерных свойств плотных контактов компонентами среды

Одним из важнейших условий существования многоклеточных животных является наличие тканевых барьеров, которые обеспечивают разграничение внутренней среды организма и внешней окружающей среды. Формирование тканевых барьеров происходит на ранних этапах развития и определяет создание различных по своему составу компартментов, что играет важную роль в развитии специализации и локализации происходящих в организме процессов. Основным элементом тканевых барьеров является слой эпителиальных или эндотелиальных клеток, объединенных в единый структурно-функциональный пласт межклеточными контактами. Нормальное функционирование тканевых барьеров обеспечивает поддержание гомеостаза в организме, в то время как нарушение целостности приводит к развитию патологических процессов и воспалительных заболеваний (Marchiando et al., 2010).

Важным для понимания функции тканевых барьеров является тот факт, что они представляют собой не просто разграничительную структуру, а являются поверхностью взаимодействия, а также полупроницаемой мембраной между двумя средами, непосредственно участвуя в формировании и поддержании постоянства внутренней среды. В настоящее время на основе строения и выполняемой функции к тканевым барьерам относят гистогематические барьеры, например, гематоэнцефалический барьер (Abbott et al., 2010), эпителий, выстилающий полость внутренних органов (Ganesan et al., 2013), а так же эпидермис кожи (Jensen and Proksch, 2009). Учитывая общую площадь поверхности, эпителий кишки представляет собой крупнейший тканевой барьер в организме между внутренней средой и средой внешней, взаимодействуя с содержимым химуса и обеспечивая всасывание питательных веществ (Метельский, 2009). Важная роль в изучении функционирования тканевых барьеров принадлежит электрофизиологическим методам исследования, которые используются для исследования особенностей транспорта и проницаемости для ионов и макромолекул.

Детальное понимание механизмов транспорта веществ через эпителиальные барьеры и роли отдельных элементов началось с пионерских опытов, проведенных под руководством Ганса Уссинга и Августа Крога (Larsen, 2002). Результатом исследований стало описание «двумембранной модели» эпителиального транспорта, которая предполагала различную проводимость апикальной и базолатеральной мембраны (Koefoed-Johnsen and Ussing, 1958). Согласно модели, ионы натрия переносятся из окружающей среды в клетку за счёт электрохимического градиента (как было показано позже – через эпителиальные натриевые каналы, ENaC), но из клетки натрий транспортируется по энергозависимому механизму через базолатеральную мембрану (как было показано позже – с помощью натрий-калиевой АТФ-азы). В результате проведенных экспериментов Уссингу удалось не только экспериментально доказать существование активного транспорта за счёт клеточной энергии, но также разработать установку для регистрации основных электрофизиологических характеристик эпителиальной ткани. К таким характеристикам относятся: разность потенциалов, описывающая разность зарядов с двух сторон эпителия; ток короткого замыкания, который позволяет оценить суммарный заряд активно транспортируемых через эпителий ионов; трансэпителиальное сопротивление – величина, главным образом отражающая проницаемость ткани для ионов и макромолекул (Clarke, 2009). Последний параметр является интегральным и включает в себя сопротивление трансцеллюлярное, то есть клеточных элементов, и сопротивление парацеллюлярное, то есть межклеточного пути. Тогда как экспериментальные данные о трансклеточном переносе ионов были получены, роль парацеллюлярного пути оставалась не исследованной. Так как для своих экспериментов Уссинг выбрал кожу лягушки, ткань с очень низкой проницаемостью парацеллюлярного пути, сформулированная двумембранная модель предполагала транспорт ионов только по трансцеллюлярному пути. Однако дальнейшее несоответствие между моделью и получаемыми данными привело к пониманию, что ионы хлора диффундируют по межклеточному пути вслед за ионами натрия за счёт электрохимического градиента (Ussing and Windhager, 1964). По аналогии с электрической цепью, парацеллюлярный путь представлял собой альтернативный способ для движения ионов через эпителий и получил название шунтового пути. На основании полученных данных было очевидно, что межклеточное пространство играет важную роль в транспорте ионов через эпителий. Существование электрохимического градиента в ткани доказывало наличие селективности и барьерных свойств парацеллюлярного пути, в противном случае все активно-транспортируемые ионы диффундировали бы обратно, и формирование градиента было бы невозможно.

В настоящее время эквивалентная схема электрической цепи эпителия выглядит следующим образом: общее трансэпителиальное сопротивление (Rтранс) включает в себя сопротивление эпителиального (Rэпи) и субэпителиальных слоёв (Rсуб), которые функционируют в качестве последовательно соединенных элементов (рис. 1). При этом субэпителиальные слои не принимают участие в формировании барьерных свойств, но вносят вклад в общее сопротивление. В свою очередь эпителиальный слой также состоит из двух элементов, но соединенных параллельно: межклеточного пространства (Rпара) и клеточной мембраны (Rтранс), которая также характеризуется ёмкостным сопротивлением (Cтранс) (рис. 1). Для изучения вклада эпителиального сопротивления в общее сопротивление используется метод одноканальной импеданс спектроскопии (One path Impedance Spectroscopy), который представляет собой модификацию классической техники Уссинга. В основе метода лежит применение не постоянного, а переменного тока, при изменении частоты которого происходит изменение ёмкостного сопротивления клеточной мембраны. Для изучения вклада парацеллюлярного и трансцеллюлярного сопротивления используется двухканальная импеданс спектроскопия, которая представляет собой комбинирование одноканальной импеданс спектрометрии и изучение диффузии маркеров по парацеллюлярному пути.

Изучение эпителиального сопротивления методом одноканальной импедансной спектроскопии

Для исключения повреждения ткани при соединении камер между собой использовались кольца из лабораторной ленты парафильм. Площадь изучаемого участка ткани определялась диаметром отверстия между половинами камер (4 мм) и равнялась 0,13 см2.

В стеклянном резервуаре циркулировало 5 мл раствора Кребса-Рингера. Раствор, омывавший серозную сторону ткани, дополнительно содержал 10 ммоль/л D-глюкозы в качестве источника энергии. Для сохранения осмотического давления раствор, омывающий «мукозную» сторону, содержал 10 ммоль/л маннита. Стеклянный резервуар имеет водяную рубашку для контроля температуры омывающего раствора (37С) и порт для аэрации карбогеном (95% О2 и 5% СО2). Для изучения электрофизиологических характеристик в каждой камере имеется порт для одного электрода напряжения и одного токового электрода, подключенных к фиксатору тока и напряжения через предусилитель (рис. 2).

Перед началом каждого эксперимента собранную без ткани установку заполняли раствором Кребса-Рингера и в условиях, соответствующих экспериментальным (температура раствора равнялась 37С и при постоянной оксигенации раствора карбогеном), выполняли компенсацию разности потенциалов на электродах напряжения и компенсацию электрического сопротивления раствора. После этого происходил повторный сбор установки с установленным препаратом ткани между камерами. Первые 10 минут после установки препарата отводились для стабилизации электрофизиологических параметров и адаптации ткани к условиям эксперимента.

Регистрация разности потенциалов (мВ) осуществлялась за счет электродов напряжения V1 и V2, расположенных с мукозной и серозной стороны ткани, соответственно. Изучение тока короткого замыкания (мкА/см2) происходило в режиме краткосрочной фиксации напряжения на величине 0 мВ и регистрации величины тока электродами I1 и I2. Для определения величины трансэпителиального сопротивления в режиме фиксации тока на величине 10 мкА регистрировали отклонение напряжения. Трансэпителиальное сопротивление рассчитывали согласно закону Ома: R = U / I (1) Учитывая площадь исследуемой ткани, полученную величину нормировали, рассчитывая ее на площадь в один квадратный сантиметр ткани (Омсм2).

Для изучения вклада эпителиального слоя Пейеровых бляшек и стенки кишки с ворсинчатым эпителием в общее сопротивление ткани этих структур использовался метод одноканальной импедансной спектроскопии (Gnzel et al., 2010). Полученная в ходе препаровки ткань монтировалась в камеры Уссинга, как описано ранее. Основной особенностью установок для данного метода являлось использование в регистрирующей системе фазочувствительного усилителя (модель 1250, Solartron Schlumberger, Farnborough, Великобритания), который регистрировал изменение напряжения в ответ на импульсы переменного тока величиной 35 мкА/см2 с варьирующей частотой от 1 Гц до 65 кГц (рис. 3). В условиях применения переменного тока ёмкостное сопротивление клеточной мембраны изменяется в зависимости от частоты тока: при применении высоких частот проводимость увеличивается, в то время как при использовании низких частот проводимость уменьшается, приравнивая условия проведения эксперимента к условиям регистрации в режиме постоянного тока (Gnzel et al., 2012). В ходе исследования полученные значения наносились на диаграмму Найквиста. Пересечение полукруга с осью икс в области низких частот указывало на значение трансэпителиального сопротивления, а пересечение с осью икс в области высоких частот — на сопротивление субэпителиальных слоёв. Значение Рисунок 3. Представление результатов импедансной спектроскопии с помощью диаграммы Найквиста Rсуб – сопротивление субэпителиальных слоёв; Rтранс – трансэпителиальное сопротивление; Rэпи – сопротивление эпителиального слоя. сопротивления эпителиального слоя высчитывалось как разница между трансэпителиальным сопротивлением и сопротивлением субэпителиальных слоёв (Рис. 1). Таким образом, использование данного метода позволило выделить и изучить сопротивление эпителиального слоя соседних участков тощей кишки.

Для изучения проницаемости эпителиального барьера ткань Пейеровых бляшек и ворсинчатого эпителия устанавливали в камеры Уссинга, как описано ранее. После стабилизационного периода, 500 мкл раствора с мукозной стороны заменяли на 500 мкл аналогичного раствора, содержавшего флуоресцентно-меченный декстран (FITC-декстран) массой 4 кДа или 20 кДа для получения финальной концентрации 5 ммоль/л и 0,1 ммоль/л, соответственно, в 5 мл омывающего раствора. Через 60 минут раствор с серозной стороны ткани отбирали для определения концентрации диффундировавшего через ткань FITC-декстрана. Для построения стандартной кривой использовались растворы с концентрацией 10, 20, 30 и 40 нмоль/л. Определение интенсивности сигнала FITC-декстрана в растворах происходило с помощью спектрофотометра Cary Eclipse (Agilent, США). Длина волны возбуждения и поглощения 490 и 520 нм, соответственно. Значение коэффициента проницаемости (Papp) рассчитывали по следующей формуле (akelj et al., 2004): Papp = (dQ / dt) / (A С0) (2), где dQ / dt – концентрация декстрана в растворе с серозной стороны через 60 минут инкубации (моль/с); A – площадь исследуемого участка ткани (см2); С0 – концентрация декстрана в растворе с мукозной стороны в начальный момент времени (моль/л); Учитывая соотношение 1 л = 1000 см3, размерность проницаемости выражается в см/с.

Сравнительный анализ электрофизиологических характеристик Пейеровых бляшек и ворсинчатого эпителия тощей кишки крысы

При анализе данных об общем сопротивлении необходимо учитывать, что препараты ткани Пейеровых бляшек и ворсинчатого эпителия, которые монтировались в камеру Уссинга, различаются по своему гистологическому строению, в том числе клеточному составу субэпителиальных слоёв, где в Пейеровых бляшках располагаются лимфоидные фолликулы. Для изучения вклада эпителиального и субэпителиального сопротивления в общее трансэпителиальное сопротивление был использован метод одноканальной импедансной спектроскопии (Gitter et al., 1998). В результате проведенных экспериментов установлено, что субэпителиальное сопротивление Пейеровых бляшек достоверно было больше сопротивления субэпителиальных слоёв ворсинчатого участка кишки в полтора раза и составляло 66 ± 5,7 и 38 ± 1,6 Омсм2, соответственно (p 0,001; n=19 и n=25; t-критерий Стьюдента) (рис. 13). Величина эпителиального сопротивления Пейеровых бляшек была равна 30 ± 5,4 Омсм2 и более чем в два раза превосходила величину сопротивления эпителия ворсинчатого участка кишки, которое составило 13 ± 1,3 Омсм2 (p 0,001; n=19 и n=25; t-критерий Стьюдента) (рис. 13). При анализе полученных данных важно учитывать различную структуру и форму фолликул-ассоциированного эпителия и эпителия ворсинчатого участка кишки и корректировать полученные данные с учетом выведенного корректирующего коэффициента. После корректировки значение эпителиального сопротивления Пейеровых бляшек было равно 79 ± 14,2 Омсм2, и больше сопротивления ворсинчатого эпителия в шесть раз (p 0,001; n=19 и n=25; t-критерий Стьюдента). При этом значения сопротивления субэпителиальных слоёв корректировке не подвергались, так как площадь серозной стороны у исследуемых препаратов не отличается и лимитирована размером отверстия камер для ткани.

Важно отметить, что при изучении трансэпителиального сопротивления с помощью двух методов, в камере Уссинга и с помощью импедансной спектроскопии, для каждой ткани были получены схожие значения трансэпителиального сопротивления, между которыми не обнаружено статистически достоверных отличий: 94 ± 5 Омсм2 и 96 ± 6 Омсм2 для Пейеровых бляшек (p 0,05; n=22, n=19; t-критерий Стьюдента) и 63 ± 4 Омсм2 и 51 ± 4 Омсм2 для ворсинчатого эпителия (p 0,05; n=22, n=19; t-критерий Стьюдента).

Таким образом, величина сопротивления эпителиального слоя, отражающая барьерные свойства эпителия в целом и парацеллюлярного пути в частности, достоверно выше в фолликул-ассоциированном эпителии по сравнению с эпителием ворсинчатого участка кишки. происхождения по межклеточному пути является важным условием сохранения антигенного гомеостаза. Для изучения проницаемости парацеллюлярного барьера эпителиальных тканей основным подходом является анализ диффузии макромолекулярных соединений, таких как пероксидаза хрена или декстран с флуоресцентной меткой (FITC-декстран). Методическим ограничением для использования пероксидазы хрена в данном исследовании являлся ее захват M-клетками фолликул-ассоциированного эпителия (Owen, 1977), в то время как данные о трансцеллюлярном переносе через эпителий FITC-декстрана в мировой литературе отсутствуют. Помимо этого, важным преимуществом FITC-декстрана является возможность использования соединений различной молекулярной массы, следовательно, разного размера, что позволяет сделать выводы о размер-селективности парацеллюлярного барьера.

Необходимо отметить, что в ходе экспериментов осуществлялась регистрация трансэпителиального сопротивления как индикатора целостности ткани. Полученные результаты демонстрировали, что добавление декстрана молекулярной массой 4 кДа и 20 кДа в раствор, омывающий мукозную сторону, и продолжительная инкубация ткани в этих условиях не оказывали влияния на ее электрические характеристики, то есть на ее проницаемость. Трансэпителиальное сопротивление Пейеровых бляшек и ворсинчатого эпителия к концу эксперимента снизилось на 3% и 15%, соответственно. Согласно исследованиям других авторов, данное снижение трансэпителиального сопротивления в ходе эксперимента принималось как допустимое и не оказывало влияния на проницаемость эпителиального слоя (Ballent et al., 2012; Stephens et al., 2002).

В результате проведенных экспериментов было показано, что ворсинчатый эпителий тощей кишки крысы проницаем для декстрана с молекулярной массой 4 кДа и 20 кДа. При этом наблюдалось снижение значения проницаемости при увеличении массы декстрана с 0,33 10-3 см/с для молекул 4 кДа до 0,013 10-3 см/с для молекул 20 кДа (p 0,05; n=5; T-критерий Вилкоксона) (рис. 14).

Эпителий Пейеровых бляшек также проницаем для FITC-декстрана молекулярной массой 4 кДа и 20 кДа, и, аналогично ворсинчатому эпителию, наблюдалось достоверное уменьшение проницаемости декстрана при увеличении его молекулярной массы. Для декстрана с молекулярной массой 4 кДа значение проницаемости составило 0,125 10-3 см/с, для декстрана молекулярной массы 20 кДа величина проницаемости составила 0,003 10-3 см/с (p 0,05; n=5; T-критерий Вилкоксона).

Сравнение данных по диффузии декстрана с различной молекулярной массой между Пейеровыми бляшками и ворсинчатым эпителием тощей кишки выявило достоверные отличия. Проницаемость эпителия Пейеровых бляшек для декстрана молекулярной массой 4 кДа достоверно меньше в три раза проницаемости ворсинчатого эпителия для этих молекул (p 0,05; n=5; T-критерий Вилкоксона). Проницаемость для декстрана с массой молекул 20 кДа в эпителии Пейеровых бляшек в четыре раза меньше по сравнению с проницаемостью ворсинчатого эпителия для этого вещества, однако не является статистически достоверной (p 0,05; n=5; T-критерий Вилкоксона).

При изучении проницаемости для молекул, аналогично изучению электрофизиологических параметров, важно учитывать различия в гистологическом строении эпителиального слоя сравниваемых препаратов. После применения корректирующего коэффициента, величина проницаемости эпителия Пейеровых бляшек для молекул массой 4 кДа и 20 кДа по-прежнему отличалась достоверно в сорок раз: 0,048 10-3 см/с и 0,0013 10-3 см/с, соответственно (p 0,05; n=5; T-критерий Вилкоксона). После применения корректирующего коэффициента разница в величине проницаемости между исследуемыми препаратами изменилась: проницаемость эпителия Пейеровых бляшек для молекул массой 4 кДа по сравнению с ворсинчатым эпителием была

Изучение локализации белков плотных контактов в эпителии Пейеровых бляшек и ворсинчатом эпителии тощей кишки

На основании полученных данных об эпителиальном сопротивлении также можно предположить, что увеличение барьерных свойств фолликул-ассоциированного эпителия Пейеровых бляшек обусловлено снижением проницаемости парацеллюлярного пути для макромолекул. Более ранние исследования, проведенные с использованием различных макромолекул, продемонстрировали, что проницаемость фолликул-ассоциированного эпителия больше по сравнению с ворсинчатым эпителием кишки (Eldridge et al., 1990; Pappo and Ermak, 1989). Однако использованные в данных исследованиях макромолекулы также транспортируются через М-клетки (Gebert et al., 1996), что не позволяет сделать вывод о барьерных свойствах парацеллюлярного пути. По сравнению с этим, флуоресцентно-меченые молекулы декстрана, которые представляют собой нейтрально заряженные полимеры глюкозы, диффундируют через эпителиальный слой только по межклеточному пути, что позволяет использовать декстран для изучения свойств парацеллюлярного барьера. В результате проведенных экспериментов показано, что для фолликул-ассоциированного эпителия тощей кишки мыши характерна меньшая величина проницаемости для молекул декстрана массой 4 кДа и 20 кДа по сравнению с ворсинчатым эпителием. Таким образом, можно заключить, что адсорбционная активность для макромолекул в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек выше по сравнению с ворсинчатым эпителием кишки, но не за счет парацеллюлярного пути, проницаемость которого для макромолекул наоборот ограничена. Это позволяет предположить, что ограничение проникновения антигенных элементов, таких как молекулы липополисахарида или других компонентов бактериальной стенки, по парацеллюлярному пути через фолликул-ассоциированный эпителий Пейеровых бляшек способствует их захвату и транспорту к иммунным клеткам через специализированные М-клетки.

Изучение белков семейства клаудина, которые являются молекулярными детерминантами парацеллюлярного транспорта, также подтверждает выдвинутое предположение о меньшей проницаемости парацеллюлярного пути. В фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек и в ворсинчатом эпителии экспрессируется одинаковый спектр клаудинов, а именно клаудин-1, -2, -3, -4, -5, -7 и -8. Важным с точки зрения транспорта по межклеточному пути является тот факт, что для фолликул-ассоциированного эпителия характерен более высокий уровень клаудина-1, -5 и -8. Согласно многочисленным литературным данным, клаудин-1 и клаудин-5 относят к белкам, повышающим барьерные свойства эпителия. Так, в исследованиях на модели мышей, нокаутных по гену клаудина-1 или клаудина-5 было показано, что животные умирали в течение первых суток и характеризовались нарушением барьерной функции для макромолекул в эпидермисе кожи и гематоэнцефалическом барьере, соответственно (Nitta et al., 2003; Tsukita and Furuse, 2002). Роль клаудина-1 и клаудина-5 в снижении парацеллюлярной проницаемости также была подтверждена в ряде экспериментов на модели клеточных линий, когда сверхэкспрессия данных белков приводила к уменьшению проницаемости и увеличению трансэпителиального сопротивления (Amasheh et al., 2005; Inai et al., 1999). В настоящее время продолжается обсуждение точной роли клаудина-8, однако показано, что увеличение экспрессии гена клаудина-8 также может приводить к увеличению трансэпителиального сопротивления (Angelow et al., 2006; Yu et al., 2003). Анализируя данные об уровне клаудинов, интересно отметить, при развитии воспалительных заболеваний кишки, в том числе болезни Крона, для ворсинчатого эпителия характерно снижение экспрессии клаудина-5 и клаудина-8 и, как результат, снижение барьерной функции ткани (Zeissig et al., 2007). Более того, в литературе неоднократно отмечается тот факт, что болезнь Крона главным образом затрагивает тощую и подвздошную кишку, то есть сегменты, где располагаются Пейеровы бляшки. Однако информация о том, происходит ли изменение экспрессии данных белков в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек при развитии болезни Крона, отсутствует.

Согласно проведенному иммуногистохимическому исследованию, все из исследуемых белков, выявленные с помощью метода Вестерн-блот анализа, были локализованы в области плотных контактов, а следовательно, вносили вклад в регуляцию барьерных свойств эпителия. При этом, по сравнению с данными из раннего исследования (Tamagawa et al., 2003), в апикальной части фолликул-ассоциированного эпителия помимо клаудина-4 были локализованы и другие представители семейства клаудина. Эти данные находятся в противоречии с предположением, что в апикальной части фолликул-ассоциированного эпителия увеличена проницаемость для патогенных структур, так как в этой области также локализованы клаудин-1, -3 и -5, увеличивающие барьерные свойства.

Таким образом, комплексное исследование, проведенное с применением электрофизиологических и молекулярно-биологических методов, позволяет говорить, что парацеллюлярная проницаемость эпителия Пейеровых бляшек для ионов и макромолекул снижена по сравнению с ворсинчатым эпителием в результате более высокого уровня отдельных представителей белков семейства клаудина. Анализируя полученные данные с функциональной точки зрения можно предположить, что ограничение парацеллюлярного транспорта в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек является одним из необходимых условий и предпосылкой для представления антигенов пищи и патогенов иммунокомпетентным клеткам через специализированные М-клетки Пейеровых бляшек. В подтверждение этой гипотезы в том числе можно рассматривать данные из литературы о захвате патогенных структур из просвета эпителия кишки дендритными клетками. В то время как в ворсинчатом эпителии отростки дендритных клеток проницают по парацеллюлярному пространству (Rescigno et al., 2001), в фолликул-ассоциированном эпителии захват дендритными клетками патогенных структур осуществляется только через специальные поры в М-клетках (Lelouard et al., 2012). Эти данные указывают на важность сохранения межклеточного барьера в фолликул-ассоциированном эпителии Пейеровых бляшек в процессе осуществления транспорта антигенных структур.

Смотрите еще:

  • Как приучить ребенка спать на животе Как приучить ребенка спать на животе Как научить ребенка спать на животе? Страхи перед СДС. Перейти на страницу: Сообщение ленчик » Вт авг 16, 2005 19:12 Сообщение Леля » Ср авг […]
  • Боли в животе на уровне пупка при беременности Боли в животе на уровне пупка при беременности Боли во время беременности Перейти на страницу: Сообщение Светлана_24 » Пн авг 31, 2009 19:18 Сообщение lalala » Пн авг 31, 2009 […]
  • Лечение язвы медом и алое Вопрос: Как использовать алоэ для лечения при язве желудка? Как применять алоэ в лечении язвы желудка? Алоэ хорошо заживляет язвы и профилактирует обострения. При этом следует правильно […]
  • Синдрома раздраженного кишечника боли в спине Синдрома раздраженного кишечника боли в спине Синдром раздраженной кишки Согласно современным представлениям, cиндром раздраженного кишечника является биопсихосоциальным […]
  • Боли в низу живота при беременности на 37 неделе Особенности 37 недели беременности 37 неделя беременности считается началом десятого акушерского месяца и вы уже на финишной прямой, когда каждый день можно ожидать начала родовой […]
  • Задержка болит низ живота температура Задержка болит низ живота температура Здравствуйте. два года не могла забереминеть,вот долгожданная задержка. сделала тест вроде две полоски,подскажите к врачу наверно рано ещё бежать. […]