Микрофлора 12 перстной кишки

Состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта у цыплят-бройлеров при воздействии пробиотика и антибиотика (по данным t-rflp-rt-pcr) Текст научной статьи по специальности «Сельское и лесное хозяйство»

Аннотация научной статьи по сельскому и лесному хозяйству, автор научной работы — Грозина А. А.

Кишечник птиц представляет собой не только первую линию защиты от экзогенных патогенов, но и самый большой орган, участвующий в обеспечении иммунитета. Микрофлора , обитающая в слепых отростках кишечника, выполняет многочисленные функции по поддержанию гомеостаза макроорганизма, в том числе играя важную роль в процессах переваривания кормов. Препараты пробиотиков, антибиотиков, пребиотиков, симбиотиков, ферментов и т.п. способны прямо или косвенно влиять на микрофлору кишечника птицы и, следовательно, увеличивают суточный прирост живой массы цыплят, сохранность, убойный выход, улучшают переваримость питательных веществ корма, качество и санитарную безопасность тушек. Однако влияние этих препаратов на микрофлору кишечника цыплят до конца не изучено. Появление и развитие современных молекулярно-генетических методов позволило изучать разнообразие микроорганизмов без ограничений, сопутствующих традиционным техникам. Мы изучили состав и возрастную динамику микрофлоры в желудочно-кишечном тракте у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 методами T-RFLP с RT-PCR при использовании добавок к полнорационному комбикорму, которыми служили пробиотик целлобактерин-Т и антибиотик стафак-110. Проведенный анализ показал, что введение в рацион птицы антибиотика и пробиотика способствовало увеличению общего числа бактерий, причем численность представителей нормофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (целлюлозолитические бактерии, лактобактерии, бифидобактерии, бациллы, селеномонады) возрастала, а доля нежелательных энтеробактерий, актиномицетов снижалась. У бройлеров из группы, получавшей пробиотик, по сравнению с птицей, в рацион которой добавляли антибиотик, в исследуемых отделах кишечника было больше целлюлозолитических бактерий, в слепых отростках в 10-100 раз больше лактобактерий, бифидобактерий, бацилл, а также меньше клостридий и транзитных бактерий. Многочисленные исследования пробиотических препаратов уже подтвердили их эффективность в птицеводстве, что отражено в зоотехнических показателях, однако только с использованием современных молекулярных методов идентификации микрофлоры желудочно-кишечного тракта (в частности, T-RFLP-анализ с RT-PCR) можно определить, на представителей каких таксономических групп микроорганизмов влияет тот или иной препарат, для дополнительного обоснования рациональности его использования.

Похожие темы научных работ по сельскому и лесному хозяйству , автор научной работы — Грозина А.А.,

GUT MICROBIOTA OF BROILER CHICKENS INFLUENCED BY PROBIOTICS AND ANTIBIOTICS AS REVEALED BY T-RFLP AND RT-PCR

In poultry, and birds in general, the gut is not only the first line of the defense from exogenous pathogens, but also the biggest immunity organ. The microflora inhabiting blind gut plays multifunctional role in the maintenance of homeostasis in macroorganism, being involved in different processes including fodder digestion. Probiotic, antibiotic, prebiotic, symbiotic preparations, enzymes, etc., affecting directly or ndirectly the gut microflora, can thus increase daily weigh growth and viability in chickens, and the slaughter yield. They also improve a digestibility of fodder nutrients, quality and sanitary condition of the birds. However, the influence of these agents on gut microflora in chickens is still not cleared up. Recent molecular approaches allow studying microbial biodiversity without traditional limitations we are faced with when applying microbiological techniques. By T-RFLP and RT-PCR, the composition and growth dynamics of gut microflora were examined in the Cobb 500 broiler chickens fed with probiotic Cellobacterin-T and antibiotic Stafak-110 as feed additives to the complete diet. By these methods, the probiotic and antibiotic additives were shown to contribute to the development of microbiota. In particular they increased the total number of bacteria, what is more, the normal gastrointestinal flora, i.e. cellulolytic bacteria, lactobacilli, bifidobacteria, bacilli, selenomonas species, increased, while the unwanted enterobateria and actinimycetes decreased. In case we used the probiotics in poultry diet when compared to antibiotics, in the studied parts of the intestinal of broiler chickens there were more cellulolytic bacteria, and in the blind gut the number of lactobacilli, bifidobacteria and bacilli was 10-100 times higher, while clostridia and transit bacteria number decreased. Numerous investigations affirmed the effectiveness of probiotics in poultry basing on zootechnical parameters, however, only molecular identification of the gut microbiota members by means of T-RFLP-PCR and RT-PCR analysis allows detecting and attributing their taxonomic groups influenced by a specific feed additive for further justification of its rational use.

Текст научной работы на тему «Состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта у цыплят-бройлеров при воздействии пробиотика и антибиотика (по данным t-rflp-rt-pcr)»

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 6, с. 46-58

Микробиология, вирусология, молекулярная биология

УДК 636.52/.58:615.33:619:579.62:577.2 doi: 10.15389/agrobiology.2014.6.46rus

СОСТАВ МИКРОФЛОРЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА У ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПРОБИОТИКА И АНТИБИОТИКА (ПО ДАННЫМ T-RFLP—RT-PCR)*

Кишечник птиц представляет собой не только первую линию защиты от экзогенных патогенов, но и самый большой орган, участвующий в обеспечении иммунитета. Микрофлора, обитающая в слепых отростках кишечника, выполняет многочисленные функции по поддержанию гомеостаза макроорганизма, в том числе играя важную роль в процессах переваривания кормов. Препараты пробиотиков, антибиотиков, пребиотиков, симбиотиков, ферментов и т.п. способны прямо или косвенно влиять на микрофлору кишечника птицы и, следовательно, увеличивают суточный прирост живой массы цыплят, сохранность, убойный выход, улучшают переваримость питательных веществ корма, качество и санитарную безопасность тушек. Однако влияние этих препаратов на микрофлору кишечника цыплят до конца не изучено. Появление и развитие современных молекулярно-генетических методов позволило изучать разнообразие микроорганизмов без ограничений, сопутствующих традиционным техникам. Мы изучили состав и возрастную динамику микрофлоры в желудочно-кишечном тракте у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 методами T-RFLP с RT-PCR при использовании добавок к полнорационному комбикорму, которыми служили пробиотик целлобактерин-Т и антибиотик стафак-110. Проведенный анализ показал, что введение в рацион птицы антибиотика и пробиотика способствовало увеличению общего числа бактерий, причем численность представителей нормофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (целлюлозолитические бактерии, лактобактерии, бифидобактерии, бациллы, селеномонады) возрастала, а доля нежелательных энтеробактерий, актиномицетов снижалась. У бройлеров из группы, получавшей пробиотик, по сравнению с птицей, в рацион которой добавляли антибиотик, в исследуемых отделах кишечника было больше целлюлозолитических бактерий, в слепых отростках — в 10-100 раз больше лактобактерий, бифидобактерий, бацилл, а также меньше клостридий и транзитных бактерий. Многочисленные исследования пробиотических препаратов уже подтвердили их эффективность в птицеводстве, что отражено в зоотехнических показателях, однако только с использованием современных молекулярных методов идентификации микрофлоры желудочно-кишечного тракта (в частности, T-RFLP-анализ с RT-PCR) можно определить, на представителей каких таксономических групп микроорганизмов влияет тот или иной препарат, для дополнительного обоснования рациональности его использования.

Ключевые слова: цыплята-бройлеры, желудочно-кишечный тракт, 12-перстная кишка, слепой отросток, микрофлора, нормальная микрофлора, патогенная микрофлора, T-RFLP, RT-PCR.

Высокие темпы мирового производства мяса птицы во многом связаны с последними достижениями в области генетики, селекции, кормления, технологий содержания и ветеринарной защиты (1). Так, современные промышленные кроссы обладают огромным генетическим потенциалом для роста и эффективной конверсии корма, что позволяет к 38-су-точному возрасту птицы получать около 2,2-2,3 кг живой массы при затратах корма на единицу прироста 1,45-1,50 кг/кг (2). У таких цыплят в 1-ю нед жизни живая масса повышается минимум в 3-4 раза, при этом желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) развивается еще быстрее. Подобные изменения часто отрицательно связаны со здоровьем птицы (как правило, чем выше продуктивность особи, тем она чувствительнее к различным стрессам), что значительно усложняет селекционное решение проблемы (3).

Многочисленные исследования позволили установить роль нормальной микрофлоры организма, которая принимает участие в функциях

* Работа выполнена в рамках гранта Российского научного фонда по научному проекту «Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-гене-тические подходы» № 14-16-00140.

сердечно-сосудистой, эндокринной, кроветворной, нервной и других систем, участвует в формировании иммунологической реактивности, выработке антибиотических соединений, белков, ферментов, гормонов, витаминов и ряда других соединений, а также предохраняет внутренние органы от внедрения и неограниченного размножения в них патогенных микроорганизмов (4-6). Через воздействие на переваримость компонентов корма и развитие систем пищеварительного тракта микрофлора существенно влияет на усвоение питательных веществ, пищевые потребности, физическое состояние и скорость роста птицы (7).

Для цыплят несколько суток накануне и после вывода считаются критическими для развития и выживания. В течение указанного периода в их организме происходит метаболический и физиологический переход от питания в яйце за счет желтка к сухому корму. При этом кишечник быстро развивается для того, чтобы эффективно использовать питательные вещества корма. Замедленное формирование кишечной микрофлоры в первые дни жизни ставит существование молодняка птицы в зависимость от санитарного состояния кормов, воды и условий содержания (8).

В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения и тот факт, что кишечник представляет собой не только первую линию защиты от экзогенных патогенов, способных колонизировать клетки и ткани хозяина, но и самый большой орган, участвующий в обеспечении иммунитета. Любые изменения в морфологии кишечника могут привести к подавлению всасывания питательных веществ, повышению секреции, развитию диареи, снижению устойчивости к болезням и продуктивности в целом (9). По сравнению с другими отделами пищеварительной системы птицы в слепых отростках кишечника численность микроорганизмов наибольшая (1010-1011 на 1 г содержимого) (10). Микрофлора, обитающая в слепых отростках кишечника, выполняет многочисленные функции по поддержанию гомеостаза макроорганизма, в том числе играя важную роль в процессах переваривания кормов

Известно, что одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является колонизационная резистентность, которая определяет ее защитные свойства. При воздействии отрицательных факторов нарушается стабильность соотношения индигенной флоры, а также адгезивность и колонизационная резистентность, что приводит к развитию патологических процессов, именуемых дисбиозами (дисбактериозами) (11). В результате таких изменений кишечник заселяется видами микроорганизмов, которые ранее не встречались в нормальной микрофлоре макроорганизма, а также начинают превалировать штаммы бактерий, которые, хотя и относятся к естественной микрофлоре, но обладают свойствами, отличающими их от облигатных бактерий тех же видов. Например, при дисбактериозах более 50 % Escherichia coli проявляют гемолитической активностью, приобретают способность образовывать гиалуронидазу, что служит признаком повышения вирулентности. Кроме того, отличительная особенность форм, выделяемых при дисбактериозах, — их множественная лекарственная устойчивость. Также в кишечнике уменьшается число лакто- и бифидобактерий, которые выполняют ряд важных функций: защищают слизистую кишечника от проникновения в кровь патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, синтезируют антибиотикоподобные вещества, органические кислоты, участвуют в синтезе витаминов группы В, стимулируют иммунную защиту организма (12-14).

Как известно, рационы для высокопродуктивной птицы составляются так, чтобы обеспечить максимально быстрый рост за небольшой

промежуток времени. В то же время повышенное содержание питательных веществ в корме часто приводит к нарушению баланса микроорганизмов в кишечнике (15). В стремлении бороться с патогенными микроорганизмами используются кормовые антибиотики, подкислители и другие химикаты, хотя далеко не все микроорганизмы с ними совместимы. Многие бактерии, например, не выдерживают экспандирования и гранулирования комбикормов (16).

В последние годы биологическая промышленность выпускает множество препаратов, которые способны прямо или косвенно влиять на микрофлору кишечника птицы и, следовательно, увеличивают суточный прирост живой массы цыплят, сохранность, убойный выход, улучшают переваримость питательных веществ корма, качество и санитарную безопасность тушек. Это пробиотики, антибиотики, пребиотики, симбиотики, ферменты и т.п. (17). Однако парадокс заключается в том, что влияние этих препаратов на микрофлору кишечника цыплят до конца не изучено.

Антибиотики добавляли в корма для животных, чтобы поддержать здоровье и экономическую эффективность производства, но из-за развития резистентности у патогенных бактерий, от которой может зависеть и здоровье людей, в странах Европы антибиотики в настоящее время исключены из рациона птицы и свиней (в Швеции — с 1986 года, в странах Евросоюза — с 2006 года) (18). Из-за бессистемного применения антибиотиков снижается численность полезной кишечной микрофлоры, более того, с периодичностью примерно 2-3 года появляются устойчивые штаммы, которые ранее не выделяли. На разработку нового антибиотика необходимо затратить существенно больше времени, а результаты не всегда соответствуют ожиданиям, так как в ряде случаев эти препараты влияют на моторную функцию ЖКТ (19). Как следствие, в последние годы возрастает актуальность поиска альтернатив для замены кормовых антибиотиков.

Пробиотические микроорганизмы стали активно применяться в странах Евросоюза с 2006 года в связи с запретом на кормовые антибиотики и некоторые антибактериальные препараты. Пробиотические препараты обычно содержат живую микробную культуру, которая может быть представителем нормальной микрофлоры ЖКТ животного: лакто- и би-фидобактерии, спорообразующие микроорганизмы, дрожжи и некоторые грибы (20). Пробиотики используют для профилактики и лечения заболеваний ЖКТ инфекционной природы, стимуляции неспецифического иммунитета, коррекции дисбактериозов пищеварительного тракта, возникающих вследствие резкого изменения состава комбикормов, при нарушениях режимов кормления и стрессах птицы во время пересадок, для замены антибиотиков в комбикормах для птицы (21).

В связи с огромным числом предложений по комбикормам и кормовым добавкам для птицеводства возникает необходимость их рационального выбора. Этот вопрос можно решить только с помощью точного, быстрого и низкозатратного мониторинга микроорганизмов в ЖКТ (22).

Большинство сведений о составе и роли микрофлоры ЖКТ у сельскохозяйственной птицы были получены с помощью классических методов микробиологии. Однако эти подходы имеют ряд существенных ограничений и недостатков. Например, не удается правильно подсчитать микроорганизмы при рассеве на питательные среды, если колония образовалась не из одной клетки, а из их скопления (23). Кроме того, зарубежными исследователями установлено, что значительная часть микроорганизмов ЖКТ представлена некультивируемыми видами, то есть формами, неспособными расти на существующих питательных средах (24). Отметим,

что проблему некультивируемых микроорганизмов следует отнести к глобальным, поскольку она признана актуальной для многих областей микробиологии — в почвоведении, растениеводстве, медицине, ветеринарии и др. Существование бактерий в отсутствие клеточной стенки — весьма своеобразное и широко распространенное явление, к которому неприменимы принципы классической микробиологии. L-трансформация бактерий с образованием L-форм затрудняет обнаружение патогенов и служит причиной многочисленных ложноотрицательных заключений по результатам биопроб, так как L-формы находятся в некультивируемом состоянии (25).

Появление и развитие современных молекулярно-генетических методов позволило изучать разнообразие микроорганизмов без ограничений, сопутствующих традиционным техникам, то есть минуя стадию культивирования. К наиболее перспективным приемам в настоящее время относят применение полимеразной цепной реакции, и в частности T-RFLP-анализ (terminal restriction fragment length polymorphism) — молекулярно-генетиче-ский метод, основанный на оценке полиморфизма длин амплифицирован-ных рестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов (26). Он предназначен для определения общей и относительной численности, а также таксономической принадлежности всех бактерий в микробной экосистеме, что дает возможность осуществлять широкомасштабное и детальное сравнительное изучение микробных сообществ в их развитии и изменении (27).

В России этот метод начал использоваться относительно недавно. В частности, компанией ООО «Биотроф» (г. Санкт-Петербург) в 2008 году методика T-RFLP-анализа была модифицирована для изучения микрофлоры ЖКТ у сельскохозяйственной птицы (28). Предложенный регламент позволяет за короткий срок максимально точно определять состав микрофлоры пищеварительного тракта, на ранних стадиях выявлять патогенные формы, а также оценивать эффект кормовых добавок в отношении микрофлоры кишечника.

Наша цель заключалась в изучении состава и возрастной динамики микрофлоры в желудочно-кишечном тракте цыплят-бройлеров методами T-RFLP с RT-PCR при использовании в качестве кормовых добавок про-биотика и антибиотика.

Методика. Научно-практический опыт выполняли на цыплятах-бройлерах кросса Cobb 500 (виварий ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП», г. Сергиев Посад, 2013 год). Цыплят выращивали в клеточных батареях типа Р-15 с 1- до 35-суточного возраста. Опытные и контрольные группы комплектовали аналогами по живой массе в 1-суточном возрасте (по 70 гол. в группе и по 35 гол. в клетке). Для кормления птицы во всех группах использовали полнорационные комбикорма в виде россыпи с питательностью согласно следующим возрастным рекомендациям по работе с используемым кроссом от фирмы-оригинатора:

0-5 сут 6-15 сут 15-36 сут

Пшеница, % 60,40 59,96 67,11

Шрот соевый, % 23,03 19,43 11,05

Шрот подсолнечный, % 6,00 7,20 7,31

Мука рыбная, % 4,00 2,50 0

Мука мясокостная, % 0 2,00 5,00

Масло соевое, % 3,11 5,33 6,00

Известняк, % 0,87 1,01 0,19

Монокальцийфосфат, % 1,00 0,70 0

Трикальцийфосфат, % 0 0,37 1,84

Витаминно-минеральный премикс, % 1,50 1,50 1,50

В I группе (контроль) птица получала сбалансированный по нормам для кросса рацион с содержанием белка животного происхождения 4,0 % (в возрасте 0-5 сут), 4,5 % (в возрасте 6-15 сут) и 5,0 % (с 15-х сут)

(OP). К OP на протяжении всего периода выращивания птицы во II опытной группе добавляли антибиотик стафак-110 («Phibro Animal Health Corporation», C0A) в дозировке 1S0 г/т корма, в III опытной группе — пробиотик целлобактерин-T (OOO «Биотроф», Pоccия) в дозировке 1 кг/т корма, используя прямое смешивание.

Для отбора проб проводили убой цыплят-аналогов по живой массе (произвольно по б гол. из каждой группы) в возрасте 1; 7; 14; 21 и 35 сут. При этом с целью получения более полного представления о микробном фоне брали особей с заполненным зобом, а 1-суточных цыплят — через 1 сут после кормления. Oтбоp содержимого 12-перстной кишки и слепых отделов кишечника в одноразовые пробирки типа эппендорф выполняли c соблюдением условий асептики. До транспортировки в лабораторию пробы помещали в морозильную камеру (-20 °C), перевозку материала осуществляли в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами (-1S °C).

T-RFLP- и RT-PCR выполняли согласно методике, разработанной австралийскими учеными (29) и опубликованной в российских источниках (30). Cовмеcтно с OOO «Биотроф» метод был апробирован (31).

ДНК для T-RFLP-анализа выделяли при помощи набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas», Литва). Для лизиса клеточных стенок в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл к навеске 200 мкг добавляли 400 мкл лизирующего раствора, перемешивали в вортексе (CVP-2, «BioSan», Латвия) и инкубировали в термошейкере (TS-100, «Biosan», Латвия) при б5 °C в течение 30 мин. Для преципитации ДНК в микроцентрифужные пробирки добавляли S00 мкл специального раствора, после чего смесь помещали в мультивортекс (V-32, «BioSan», Латвия), а затем центрифугировали в настольной центрифуге («Beckman Coulter», C0A) (14000 оборотов/мин, 10 мин). Oтделяли осадок, тщательно перемешивали в вортексе со 100 мкл раствора NaCl и 300 мкл 9б % этилового спирта и центрифугировали в том же режиме, после чего осадок помещали в термостат Гном Россия) при 45 °C до полного высушивания. К осадку добавляли 100 мкл стерильной дистиллированной воды и перемешивали смесь в вортексе. Полученный раствор ДНК хранили в морозильной камере при -20 °C до дальнейших исследований. Качество препарата ДНК оценивали с использованием электрофореза в 1 % агарозном геле в камере («Bio-Rad», C0A) с TAE-буфером («Fermentas», C0A); маркер молекулярных масс — Gene Ruler («Fermentas», C0A) по 3 мкл (режим разделения — 50 В, 1 ч). Гели просматривали и результаты документировали с помощью трансиллюминатора («New England BioGroup», C0A).

При T-RFLP-PCR-амплификации использовали следующие реагенты («Fermentas», C0A); праймеры — 10 пМ; Taq-полимераза — 10 ед., х10 буфер для Taq-полимеразы; MgCl2 — 2,5 мМ; смесь дезоксинуклеозидтри-фосфатов — 2,5 мМ; ДНК-матрица — 10 нг. Для амплификации гена 16S-pPHК бактерий подбирали специфичные варианты олигонуклеотидов (63f, l087r) с флуоресцентной меткой 5′-конца. Дополнительно к опытным пробам использовали негативный (смесь без ДНК) и позитивный (успешно ам-плифицированная ДНК) контроли. Pеaкцию проводили в программируемом амплификаторе iCycler («Bio-Rad», C0A) в следующем режиме; денатурация — 95 °C, 3 мин; 34 цикла (денатурация; отжиг; элонгация) — 95 °C, 30 с; 42-60 °C, 30-60 с; 72 °C, 1 мин; элонгация — 72 °C, 10 мин. Качество образцов оценивали с использованием электрофореза («Bio-Rad», C0A), как было описано выше, с учетом размера фрагментов и чистоты ДНК.

Oчиcтку ДНК-фрагментов из блоков агарозного геля проводили с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas», Лит-

ва) согласно прилагаемым инструкциям. Преципитат ДНК растворяли в 15 мкл деионизированной воды и использовали для рестрикции с применением набора реагентов («Fermentas», США: 1,5 мкл буфера для рестрикции; 10 ед. рестриктазы (HaelII, HhaI и MspI); деионизированная вода — до 15 мкл). Реакцию останавливали прогреванием при 72 °С 20 мин.

Для капиллярного электрофореза полученных фрагментов к пробам после стандартной подготовки добавляли по 0,2 мкл маркера (набор для определения размера фрагментов ДНК Size Standart 600, «Beckman Coulter», США). Образцы анализировали, используя автоматический секвена-тор CEQ8000 («Bechman Coulter», США) с программой для подсчета длины фрагментов.

Данные T-RFLP-PCR оценивали по интенсивности флуоресценции проб (10-200 тыс. ед.) и длине контрольных фрагментов (600 п.н.), после чего в MS Exсel получали матрицу данных и определяли филогенетическую принадлежность микроорганизмов с помощью программы FragSort (http://mica.ibest.uidaho.edu). Точную таксономическую принадлежность филотипов определяли на основе обработки проб для всех трех эндонуклеаз (HaeIII, HhaI и MspI) с вычислением их процентной доли в микробном сообществе.

Рис. 1. Пример электрофореграммы препаратов ДНК, используемых для анализа состава микрофлоры кишечника птицы в T-RFLP—RT-PCR: М — маркер молекулярных масс Gene Ruler («Fermentas», США), 1-6 — исследуемые пробы ДНК (1 % агарозный гель, TAE-бу-фер, 50 В, 1 ч).

при оценке количественного содержания конкретной группы микроорганизмов проводили выделение, контроль качества ДНК и амплификацию гена 16Б-рРНК, как бышо описано выше (Юус1ег, «Бю-Яаё», США), используя не один, а четыре позигивныж контроля (ДНК определяемого микроорганизма в серии концентраций геномов). В режиме реального времени программа амплификатора строила калибровочный график, согласно которому вычислялось количество геномов в опыгтныш пробах. Математическую обработку результатов выполняли в программе МБ Ехсе1.

Результаты. Оценка качества образцов ДНК с использованием

200 250 300 350 Длина фрагментов, нт

Рис. 2. Пример паттерна, отражающего результаты электрофореза фрагментов при анализе состава микробного сообщества в кишечнике птицы методом Т-КЕЬР-РСЯ (серым цветом отмечены маркерные пики, черным — профиль фрагментов в образце).

электрофореза в агарозном геле подтвердила, что фрагментация в них не превышает допустимого уровня (рис. 1). Пример паттерна, отражающего результаты электрофореза при анализе состава микробного сообщества, приведен на рисунке 2.

Использованный нами в эксперименте антибиотик стафак-110 обладает бактериостатическим, а в высоких концентрациях — бактерицидным действием в отношении большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий. Действующее вещество (вирджиниами-цин) не всасывается в желудочно-кишечном тракте и не подвергается воздействию пищеварительных ферментов, поэтому создается его высокая концентрация, что способствует длительному антимикробному действию в ЖКТ. Вирджиниамицин не накапливается в органах и тканях и выводится из организма в неизмененном виде с фекалиями (32). Пробиотик целло-бактерин-Т — это препарат комплексного действия, созданный на основе ассоциации микроорганизмов, выделенных из рубца жвачных (33). Содержит целлюлозолитические и молочнокислые бактерии и обладает свойствами пробиотика профилактического назначения и свойствами ферментного препарата. Бактерии, входящие в состав ассоциации, образуют ферменты, которые способны гидролизовать клетчатку корма, — ксиланазы, пектиназу и ß-глюканазу. Это позволяет применять препарат в качестве добавки к кормам с увеличенным содержание клетчатки, используемым при выращивании животных и птицы.

1. Возрастная динамика общего числа бактерий (геномов/г) в содержимом желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 при использовании антибиотика и пробиотика в качестве кормовых добавок (по данным T-RFLP-RT-PCR)

Группа | Отдел ЖКТ | 1 сут | 7 сут | 14 сут | 21 сут | 35 сут

I (контроль) 12-перстная кишка 9,6* 107 2,6* 108 2,1* 108 1,5* 109 2,2* 109

Слепая кишка 7,0*109 1,6*1010 2,2* 101° 2,8* 1010 8,3*1010

II (антибиотик стафак- 12-перстная кишка 1,9* 1010 6,4* 109 1,3* 109 1,5*109 7,1*109

110) Слепая кишка 2,5*10« 1,4*1011 2,4* 109 3,1*1010 6,3*1010

III (пробиотик целло- 12-перстная кишка 4,0*10« 1,1*108 1,5* 109 2,3*109 7,0*1010

бактерин-Т) Слепая кишка 1,4*1010 1,2*10″ 1,3*10И 2,6* 1010 8,3*1010

Определение общего числа бактерий в исследованных пробах показало, что в обеих опытных группах (с введением в рацион антибиотика и пробиотика) оно было выше, чем в контроле (табл. 1). Наиболее явные различия наблюдали в исследуемых отделах ЖКТ у цыплят в возрасте 1-14 сут. Так, через 1 сут после кормления в группах с применением антибиотика и пробиотика численность бактерий в 12-перстной кишке и слепых отростках была соответственно в 100 и в 10 раз выше по сравнению с контролем. Полученные результаты свидетельствуют о более быстром заселении ЖКТ микрофлорой у цыплят из опытных групп, что важно для развития кишечника. В 7- и 14-суточном возрасте у бройлеров из II и III групп численность бактерий в 12-перстной кишке и слепых отделах кишечника в 10 раз превышала контроль, кроме того, в возрасте 14 сут у цыплят из опытных групп в слепых отростках анализируемый показатель был в 100 раз выше, чем у получавших антибиотик, что могло быть связано со сменой рациона и повышением содержания животного белка в комбикорме. На 21-е сут численность бактерий в исследуемых отделах ЖКТ между группами практически не различалась. У 35-суточных цыплят эти показатели в пробах также существенно не разнились. Исключение составила II группа, получавшая пробиотик, в которой общая численность бактерий в 12-перстном отделе кишечника была в 10 раз выше, чем в осталь-

Среди представителей нормоценоза кишечника значительную роль играют целлюлозолитические бактерии следующих семейств: Bacteroidacea (бактероиды), Lachnospiracea (лахноспиры), Ruminococcacea (руминококки), Thermoanaerobacteriacea (термоанаэробактерии), Clostridiacea (клостридии) (34). Поскольку у птиц практически отсутствуют собственные пищеварительные ферменты для расщепления целлюлоз и других некрахмалистых полисахаридов, роль этих микроорганизмов в пищеварении у цыплят-бройлеров трудно переоценить.

На основании произведенного расчета в изучаемых микробных сообществах наибольшей оказалась суммарная доля целлюлозолитиков в слепых отростках у бройлеров из групп, получавших пробиотик и антибиотик (табл. 2).

2. Возрастная динамика численности нормальной микрофлоры (геномов/г) в содержимом желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 при использовании антибиотиков и пробиотиков в качестве кормовых добавках (по данным T-RFLP-RT-PCR)

Группа | Отдел ЖКТ | 1 сут | 7 сут | 14 сут | 21 сут | 35 сут

Целлюлозолитические бактерии Целлюлозолитики

I(контроль) 12-перстная кишка 1,9х107 1,6*107 1,1*107 2,4*108 5,8* 106

Слепая кишка 7,0х105 1,9*109 3,6*109 9,4*109 8,7*109

II (антибиотик стафак- 12-перстная кишка 1,1х109 6,8*108

Свидетельство о регистрации СМИ Эл № ФС77-52970

Микрофлора 12 перстной кишки

Целью работы явилось проведение сравнительного анализа микрофлоры кишечника у здоровых лиц и лиц с заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

Проведен анализ 665 истории болезни лиц в возрасте от 5 до 69 лет, находившихся на лечении, а также обследуемых на дисбиоз в ГУЗ «Оренбургская областная клиническая больница №1». Все обследуемые были разбиты на две группы: клинически здоровые (75 человек); больные с заболеваниями желудочно-кишечного тракта: колит, панкреатит, гастрит, язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (590 человек). В результате бактериологического исследования было выделено и идентифицировано 2396 штаммов микроорганизмов. От здоровых лиц было выделено 254 штамма, при этом облигатная микрофлора (1 группа) выделялась в 97,3% случаев, и была представлена микроорганизмами родов Bifidobacterium sp. и Lactobacillus sp. и видом E. coli, факультативная микрофлор (2 группа) высевали в 1,3% случаев и была представлена P. vulgaris, C. diversus, K. oxytoca, E. aerogenes. Патогенная микрофлора составила 13,3 и была представлена E. coli со слабо выраженными ферментативными свойствами, гемолитической
E. coli и S. аureus. От лиц с заболеваниями желудочно-кишечного тракта было выделено 2142 штамма, среди которых представителей 1 группы обнаруживали в 97,4% случаев. Факультативная микрофлора, выделяли в 16,8% случаев и отличалась большим разнообразием так, наряду с P. vulgaris, P. mirabilis, C. diversus, С. freundii, K. oxytoca, E. aerogenes, S. saprophyticus в единичных пробах были обнаружены C. albicans, C. intermedia, K. pneumoniae, K. ozaenae, E. agglomerans, S. epidermidis, P. rettgeri, P. alcalifaciens,
P. aeruginosa, S. marcescens. Патогенные микроорганизмы выделены в 19,5% случаев.

При проведении сравнительного анализа микрофлоры установлено, что у лиц с заболеваниями желудочно-кишечного тракта факультативная микрофлора регистрировалась с большей частотой (16,8%) и различалась по видовому составу.

МИКРОФЛОРА ЖКТ

МИКРОФЛОРА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНОГО ТРАКТА

Нормальная микрофлора (нормофлора) желудочно-кишечного тракта является необходимым условием жизнедеятельности организма. Микрофлора ЖКТ в современном понимании рассматривается как микробиом человека.

Нормофлора (микрофлора в нормальном состоянии) или Нормальное состояние микрофлоры (эубиоз) — это качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие, необходимое для сохранения здоровья человека. Важнейшей функцией микрофлоры является ее участие в формировании резистентности организма различным заболеваниям и обеспечение предотвращения колонизации организма человека посторонними микроорганизмами.

В любом микробиоценозе , в том числе кишечном, всегда имеются постоянно обитающие виды микроорганизмов — 90% , относящиеся к т.н. облигатной микрофлоре (синонимы: главная, автохтонная, индигенная, резидентная, обязательная микрофлора), которой отведена ведущая роль в поддержании симбиотических отношений между макроорганизмом и его микробиотой, а также в регуляции межмикробных отношений, а также существуют добавочные (сопутствующая или факультативная микрофлора) — около 10% и транзиторные (случайные виды, аллохтонная, остаточная микрофлора) — 0,01%

Т.е. вся микрофлора кишечника подразделяется на:

  • облигатнуюглавнаяилиобязательная микрофлора, около 90% от общего числа микроорганизмов. В состав облигатной микрофлоры преимущественно входят анаэробные сахаролитические бактерии: бифидобактерии (Bifidobacterium), пропионовокислые бактерии (Propionibacterium), бактероиды (Bacteroides), лактобактерии (Lactobacillus);
  • факультативнуюсопутствующаяилидобавочная микрофлора,составляет около 10% от общего числа микроорганизмов. Факультативные представители биоценоза: эшерихии (кишечные палочки — Escherichia), энтерококки (Enterococcus), фузобактерии (Fusobacterium), пептострептококки (Peptostreptococcus), клостридии (Clostridium) эубактерии (Eubacterium) и др., безусловно, обладают рядом физиологических функций, важных для биотопа и организма в целом. Однако преобладающая их часть представлена условно-патогенными видами, которые при патологическом увеличении популяций могут вызывать серьезные осложнения инфекционного характера.
  • остаточнуютранзиторная микрофлора или случайные микроорганизмы, менее 1% от общего числа микроорганизмов. Остаточная микрофлора представлена различными сапрофитами (стафилококки, бациллы, дрожжевые грибки) и прочими условно-патогенными представителями энтеробактерий, к которым относятся кишечные: клебсиеллы, протеи, цитробактеры, энтеробактеры и т.д. Транзиторная микрофлора (Citrobacter, Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Morganella, Serratia, Hafnia, Kluyvera, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, дрожжи и дрожжеподобные грибы и др.), в основном, состоит из особей, занесенных извне. Среди них могут случаться варианты с высоким агрессивным потенциалом, которые при ослаблении защитных функций облигатной микрофлоры способны увеличивать популяции и вызывать развитие патологических процессов.

В желудке микрофлоры содержится мало, значительно больше ее в тонком отделе кишечника и особенно много в толстой кишке. Стоит отметить, что всасывание жирорастворимых веществ, наиважнейших витаминов и микроэлементов происходит преимущественно в тощей кишке. Поэтому систематическое включение в рацион пробиотических продуктов и биодобавок, которые содержат микроорганизмы, регулирующие процессы кишечного всасывания, становится очень эффективным инструментом в профилактике и лечении алиментарных заболеваний.

Кишечное всасывание — это процесс поступление различных соединений через слой клеток в кровь и лимфу, в результате чего организм получает все необходимые ему вещества.

Наиболее интенсивное всасывание происходит в тонкой кишке. Благодаря тому, что в каждую кишечную ворсинку проникают мелкие артерии разветвляющиеся на капилляры, всасываемые питательные вещества легко проникают в жидкие среды организма. Глюкоза и расщепленные до аминокислот белки всасываются в кровь посредственно. Кровь, несущая глюкозу и аминокислоты, направляется к печени, где происходит отложение углеводов. Жирные кислоты и глицерин — продукт переработки жиров под воздействием желчи — всасываются в лимфу и уже оттуда попадают в кровеносную систему.

На рисунке слева (схема строения ворсинки тонкого кишечника): 1 — цилиндрический эпителий, 2 — центральный лимфатический сосуд, 3 — каппилярная сеть, 4 — слизистая оболочка, 5 — подслизистая оболочка, 6 — мышечная пластинка слизистой оболочки, 7 — кишечная железа, 8 — лимфатический канал.

Одно из значений микрофлоры толстого кишечника заключается в том, что она участвует в конечном разложении остатков непереваренной пищи. В толстом кишечнике пищеварение завершается гидролизом не переварившихся остатков пищи. Во время гидролиза в толстом кишечнике участвуют ферменты, которые поступают из тонкой кишки, и ферменты кишечных бактерий. Происходит всасывание воды, минеральных солей (электролитов), расщепление растительной клетчатки, формирование каловых масс.

Микрофлора играет значительную (!) роль в перистальтике, секреции, всасывании и клеточном составе кишечника. Микрофлора участвует в разложении ферментов и других биологически активных веществ. Нормальная микрофлора обеспечивает колонизационную резистентность — защиту слизистой кишечника от болезнетворных бактерий, подавляя патогенные микроорганизмы и предупреждая инифицирование организма. Ферменты бактерий расщепляют волокна клетчатки , непереваренные в тонкой кишке. Кишечная флора синтезирует витамин К и витамины группы В , ряд незаменимых аминокислот и ферменты необходимые организму. С участием микрофлоры в организме происходит обмен белков, жиров, углеродов, желчных и жирных кислот, холестерина , инактивируются проканцерогены (вещества, способные вызывать рак), утилизируются избытки пищи и формируются каловые массы. Роль нормофлоры чрезвычайно важна для организма хозяина, именно поэтому ее нарушение ( дисбактериоз ) и развитие дисбиоза в целом, приводит к серьезным заболеваниям метаболического и иммунологического характера.

Состав микроорганизмов в определённых отделах кишечника зависит от многих факторов: образ жизни, питание, вирусные и бактериальные инфекции, а также медикаментозное лечение, особенно приём антибиотиков. Многие заболевания ЖКТ, включая воспалительные, также могут нарушать экосистему кишечника. Результатом этого дисбаланса являются часто встречающиеся пищеварительные проблемы: вздутие, диспепсия, запор или диарея и т.д.

Кишечная микрофлора (кишечный микробиом) представляет собой необычайно сложную экосистему. У одного индивида насчитывается по меньшей мере 17 семейств бактерий, 50 родов, 400-500 видов и неопределённое число подвидов. Микрофлора кишечника подразделяется на облигатную (микроорганизмы, постоянно входящие в состав нормальной флоры и играющие важную роль в метаболизме и противоинфекционной защите) и факультативную (микроорганизмы, часто встречающиеся у здоровых людей, но являющиеся условно-патогенными, т.е. способными вызывать заболевания при снижении резистентности макроорганизма). Доминирующими представителями облигатной микрофлоры являются бифидобактерии .

В таблице 1 указаны наиболее известные функции кишечной микрофлоры (микробиоты), в то время как ее функционал намного шире и еще изучается

Смотрите еще:

  • Говяжьи кишки что приготовить Кишка тонка. Как приготовить колбасу в домашних условиях Для изготовления колбасных изделий обязательно понадобятся говяжьи или свиные кишки. Колбасу принято считать не самым полезным […]
  • Сколько после чистки болит живот Боли после выскабливания замершей беременности Здравствуйте! очень нужен совет. у меня случилась беда и первая желанная беременность оказалась замершей. Определили на первом узи на 12 […]
  • Лечение кожной формы сибирской язвы Сибирская язва Сибирская язва (anthrax, злокачественный карбункул) – это острое зоонозное заболевание (бактериальная инфекция), для которого характерно развитие серозно-геморрагического […]
  • Почему болит живот после поцелуев Поцелуй и не болей Во время поцелуя партнеры иммунизируют друг друга, но могут и заразить Поцелуи укрепляют сердце, иммунитет и даже зубы, но в то же время не исключают опасности […]
  • Опух живот внизу справа Боль внизу живота опух посоветуйте. Женское здоровье Здравствуйте. Не знаю прямо что делать. Мне 45 лет. Начался ранний климакс-прекратились месячные, измерила ФСГ- он достигает 49. […]
  • Сибирская язва диагностика лечение Сибирская язва Сибирская язва является острым, особо опасным инфекционным заболеванием, возникающим у человека и животных при заражении Bacillus anthracis, протекающим с формированием на […]